CRISPRscreen结合细胞系的分子和基因图谱有助于系统识别癌症的弱点。这些大规模筛选，以及体内和等基因细胞系筛选，已经发现了越来越多的有潜力的治疗靶点，并直接推动了许多特定靶点的药物研发项目，其中一些已经进入临床试验阶段。2021年12月，Broad研究所癌症依赖性图谱（theCancerDepencyMapProject(DepMap)）的项目负责人FranciscaVazquez在《CancerResearch》杂志回顾了基于screen发现的肿瘤治疗靶点。

CancerRes(2021)81(23):5806–5809.

急性髓系白血病（AML）是一种异质性血液系统恶性肿瘤，其特征在于异常成髓细胞的积累。尽管化疗和干细胞移植对某些患者有效，但AML的治愈率仍然在35％~40％之间（老年人中低于15％），仍需要额外的努力来发现新的治疗策略。基于CRISPRScreening的第一代大规模的功能基因组筛选已经完成，如Broad研究所和Sanger中心的癌症依赖性图谱（），这些研究揭示了体外培养的AML细胞数百种潜在的遗传脆弱性。然而，如何辨别这些靶点的转化潜力仍然是巨大的挑战。因此，需要二代功能确证方法对这些基因靶标进行优先排序从而指导新的抗白血病治疗药物研发。

CRISPR筛选的实验设计

以往的大规模基因组筛选主要是在体外完成的，因此，在优先排序候选基因时要考虑的一个重要因素就是在合适的体内微环境中评估其重要性，因为生态位会影响肿瘤细胞的生理行为。人AML原位疾病模型在生理学上是相通的，因为AML细胞会移植到小鼠的骨髓微环境中。已经在血液恶性肿瘤的几种基因工程小鼠模型中进行了体内CRISPRScreening，但尚未在人AML原位异种移植瘤模型中证实这种方法的可行性。

CRISPR筛选的三种模式

2022年2月9日，Dana-Farber癌症研究所的KimberlyStegmaier实验室和冷泉港实验室的实验室在《CancerDiscovery》杂志分别报道了基于原位异种移植模型的CRISPRScreening，系统评估了AML中具有极高转化潜力的靶点基因。有趣的是，两个实验室同时发现SLC5A3是外源性肌醇依赖性AML的代谢脆弱性。

CancerDiscov(2022)12(2):432–449.CancerDiscov(2022)12(2):450–467.

Stegmaier实验室优化了原位异种移植瘤的CRISPRScreening方案，除在AML细胞中进行体内CRISPR筛选，还建立了可以进行CRISPR筛选的PDX模型。针对其他研究中富集的200种AML依赖性基因，他们分别设计sgRNAs进行体内CRISPR筛选，聚焦于那些以前从未报道过的AML依赖性靶标。他们的研究除发现钠/肌醇协同转运体SLC5A3作为代谢脆弱性外，还线粒体E3泛素连接酶MARCH5是AML中的关键凋亡调节因子，这两者都代表了新的治疗机会。

在人类AML中进行体内CRISPR筛选

紧接着，研究人员在体内外实验种进一步确证了AML细胞对SLC5A3和MARCH5的生存依赖性。敲除MARCH5明显诱导凋亡（cleavedcaspase3和AnnexinV↑），而敲除线粒体凋亡效应因子BAX或BAK1可以逆转MARCH5缺失细胞的凋亡诱导和生长抑制。进一步的机制研究发现，MARCH5敲除会上调一种含有BH3结构域的促凋亡蛋白NOXA的表达，而NOXA与BCL2家族蛋白MCL1相互作用并抑制MCL1的抗凋亡作用，这与此前的研究MARCH5可以降解MCL1-NOXA复合物是一致的。此外，MARCH5敲除还可以增加AML细胞对BCL2抑制剂venetoclax的敏感性。

抑制MARCH5激活线粒体凋亡通路

ChrisVakoc实验室的研究集中在肌醇转运体SLC5A3基因，主要是在AML细胞系MOLM-13的体内模型中筛选完成。肌醇是真核细胞中一种丰富的碳环糖，是脂质磷脂酰肌醇（PI）的头部成分，在生长因子信号传导中的重要信号传导分子。肌醇的磷酸化状态受激酶（PI3K）和磷酸酶（PTEN）调节，从而控制AKT-mTOR信号。此外，磷脂酶C可以从PI中释放肌醇三磷酸，作为第二信使促进内质网钙释放。

基于domain-focusedCRISPR筛选方法鉴定AML体内依赖性

肌醇合成（）

ChrisVakoc实验室的研究证实SLC5A3是肌醇营养缺陷型AML生长必不可少的。SLC5A3依赖性AML细胞的共性是ISYNA1基因的转录沉默，限制了细胞内肌醇的从头合成。通过gain-和loss-of-function实验来揭示揭示了ISYNA1和SLC5A3在AML中的合成致死作用。

ISYNA1的转录沉默通过合成致死基因相互作用导致SLC5A3依赖

总之，两项独立研究共同揭示了肌醇（Myo-intositol）在AML中的营养依赖性，这是由肌醇生物合成酶的异常沉默引起的，靶向SLC5A3可能是AML治疗新的潜在合成致死策略。

AML中SLC5A3和ISYNA1之间的合成致死模型

参考文献

VazquezF,?.;81(23):5806-5809.

Bock,C.,Datlinger,P.,Chardon,,8(2022).

LinS,LarrueC,ScheideggerNK,sinAML.

.2022;12(2):432-449.

WeiY,HuangYH,SkopelitisDS,;12(2):450-467.

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