编译：微科盟JQKA，编辑：微科盟景行、江舜尧。

导读

苹果是中国一种重要的经济作物，它容易受到真菌感染，对其产量产生有害影响。由炭疽病菌引起的苹果苦腐病是苹果最严重的真菌病害之一。水杨酸（SA）是植物抗病信号通路中的关键信号分子。木质素的合成在赋予抗病性方面也起着关键作用。然而，苹果SA抗病信号通路与木质素抗病通路之间的关系研究较少。MdMYB46已经被证明可以促进苹果中木质素的积累，并增强对盐和渗透胁迫的耐受性。在本研究中，研究者探究了MdMYB46与生物胁迫之间的关系，结果发现过表达MdMYB46增强了苹果对炭疽病菌的抗性。研究者还通过酵母文库筛选鉴定了一个MdMYB46上游的转录因子MdARF1，并通过psRNATarget预测确定了MdARF1受miR7125调控。研究者通过LUC和qRT-PCR实验证实了这一调控关系，表明miR7125负调控MdARF1。研究者对miR7125启动子的分析表明，miR7125响应SA信号。SA水平的积累会导致miR7125表达水平的下降。总之，本研究结果为苹果对炭疽病菌抗性的分子机制提供了新的见解，并揭示了响应SA信号增强苹果木质素积累的新途径。这些发现为今后培育苹果抗病育种提供了有价值的信息。

论文ID

原名：ThemiR7125-MdARF1moduleenhancestheresistanceofappletoColletotrichumgloeosporioidesbypromotingligninsynthesisinresponsetosalicylicacidsignalling

译名：miR7125-MdARF1模块通过促进木质素合成响应水杨酸信号增强苹果对炭疽病的抗性

期刊：PlantBiotechnologyJournal

IF：10.1

发表时间：2024年6月

通讯作者：马跃，王丰

DOI号：10.1111/

实验设计

结果

1过表达MdMYB46增强了对炭疽病菌的抗性

前期研究表明，MdMYB46促进了苹果木质素的积累，增强了植株对盐和渗透胁迫的抗性。为了探讨MdMYB46在生物胁迫中的作用，验证其对真菌胁迫的作用，研究者获得了“Hanfu”（一个苹果品种）的MdMYB46转基因植株，并对其抗病能力进行了评价。MdMYB46-OE2转基因苹果株系以及非转基因的“Hanfu”株系接种炭疽病菌，并在接种后第3天和第5天记录了病害程度（图1a、b）。到第3天，“Hanfu”和过表达MdMYB46的植株叶片均明显出现棕色病变。到第5天，苹果叶片表面病变面积和数量增加。过表达MdMYB46的植物比非转基因植物具有更强的抗病能力，非转基因“Hanfu”植株的病害指数明显高于过表达MdMYB46植株。研究者通过针注射将炭疽病孢子接种于MdMYB46-OE2以及“Hanfu”离体叶片。在第3天和第5天，“Hanfu”苹果叶片上的病变区域比MdMYB46过表达更广泛(图1c，d)。为了确定在苹果果实中观察到的抗病性是否与叶片相一致，通过农杆菌介导的转化，研究者获得了pRI101-MdMYB46和pRI101-RNAi-MdMYB46苹果果实。在MdMYB46沉默的果实中病变最广泛，而在MdMYB46过表达果实中病变最不广泛。这一观察结果表明，MdMYB46的过表达增强了抗病能力（图1e，f）。综上所述，过表达MdMYB46增强了苹果对炭疽病的抗性。

图1.过表达MdMYB46转基因植株和苹果果实的抗病性分析。(a)“Hanfu”、MdMYB46-OE2（转基因株系）感染炭疽病表型，比例尺1cm。(b)“Hanfu”和2个MdMYB46转基因株系病害指数。(c)“Hanfu”、MdMYB46-OE2植株离体叶片感染炭疽病表型，比例尺1cm。(d)离体叶片病变区分析。(e)感染炭疽病瞬时表达pRI101-MdMYB46、pRI101-RNAi-MdMYB46、pRI101-AN（pRI101-MdMYB46对照）、pRI101-RNAi（pRI101-RNAi-MdMYB46对照）的表型，比例尺1cm。(f)苹果果实病变的直径分析。误差线表示三个生物重复的标准偏差（SD）。星号表示差异显著（*P＜0.05，基于t检验）。

2MdMYB46上游转录因子的筛选与鉴定

为进一步证实MdARF1与MdMYB46启动子体外结合，研究者使用纯化的GST-MdARF1蛋白进行了电泳迁移率测定（EMSAs），包含MdARF1（GACA）识别位点的50bp左右的MdMYB46启动子，在3’端进行反向互补和生物素标记，并作为标记探针；使用不含生物素标记的序列作为冷探针，而那些在结合位点上发生突变的基因则作为突变体探针。结果显示，在第1泳道，空的GST蛋白与生物素标记的探针共孵育，没有产生任何条带。在同时添加生物素标记的探针和GST-MdARF1蛋白到第2泳道后，GST-MdARF1蛋白与MdMYB46启动子上的GACA基序结合，产生一个清晰的条带。当将生物素标记的探针和GST-MdARF1蛋白加入第3泳道时，非生物素标记的冷探针的数量增加了20倍，但竞争效应并不明显。因此，在第4泳道，研究者观察到冷探针多了100倍，这导致了条带的明显位移。在第5泳道中，生物素标记的探针GST-MdARF1蛋白并添加了一个20倍以上的非生物素标记的突变体探针；在第6泳道中，引入了一个100倍以上的突变体探针。20倍和100倍以上的突变体探针都没有迁移结合条带，也没有损害GST-MdARF1蛋白与GACA基序的结合能力（图2b）。这些发现进一步表明，MdARF1在体外直接与MdMYB46启动子相互作用。染色质免疫共沉淀(ChIP)-qPCR结果显示，缺乏GACA结合位点的C1，而C2则含有这些位点。MdMYB46在携带GFP信号的MdARF1样本中高度富集，证实了MdARF1在体外直接与MdMYB46启动子结合（图2c）。

为了进一步研究MdARF1在调控MdMYB46启动子转录活性中的作用，研究者进行了LUC检测。研究者将MdMYB46启动子连接到LUC报告基因的上游，得到pMdMYB46::LUC启动子载体；将强35S启动子连接到MdARF1基因的CDS上，得到35S::MdARF1载体。研究者利用农杆菌介导的瞬时表达生成pMdMYB46::LUC和35S::MdARF1，它们在烟草叶片中瞬时表达，并使用体内荧光成象仪拍摄了烟草的图片；以空载体和LUC作为对照。结果显示，当pMdMYB46::LUC和35S::MdARF1在烟草叶片中共表达时，MdMYB46的启动子活性较对照组增强（图2d）。

研究者还通过qRT-PCR检测了两个MdARF1过表达系中MdMYB46的表达，结果发现，MdARF1表达的升高促进了MdMYB46的表达，进一步表明MdARF1是MdMYB46上游的正向转录因子（图2e）。综上所述，这些结果表明MdARF1直接与MdMYB46的启动子结合，并正向调控其表达。

图2.MdARF1结合MdMYB46启动子的鉴定。(a)MdMYB46上游转录因子的Y1H筛选。(b)EMSA证实MdARF1与MdMYB46启动子的结合。(c)CHIP-qPCR证实MdARF1与MdMYB46启动子结合。C1没有GACA结合位点，而C2有GACA结合位点。(d)LUC分析证实MdARF1与MdMYB46之间的调控关系。(e)qRT-PCR分析MdARF1过表达的苹果植株中MdMYB46的表达水平。误差线表示三个生物重复的标准偏差（SD）。星号表示差异显著（**P＜0.01，基于t检验）。

3苹果中转录因子MdARF1的鉴定

研究者比较了MdARF1及其拟南芥同源基因的保守结构域。结果表明，MdARF1结构域包含了三个保守的基序：B3、Auxin-resp和AUX-IAA。MdARF1与其拟南芥同源基因之间的基序是保守的，三个盒对应于这三个基序。为了确定MdARF1在植物细胞中的定位，研究者将CDS区（无终止密码子）插入GFP标记中，构建MdARF1-GFP融合基因，利用农杆菌介导的瞬时表达在烟草中表达MdARF1-GFP。定位结果显示，MdARF1定位于细胞核内（图3a）。为了研究MdARF1是否具有转录激活功能，研究者将MdARF1的CDS序列插入酵母表达载体pGBKT7中，并将重组质粒导入酵母细胞中，验证其转录活性。结果表明，全长MdARF1具有转录激活功能（图3b）。这些结果表明，MdARF1是一种定位于细胞核的转录激活因子。

图3.转录因子MdARF1的鉴定。(a)MdARF1-GFP在烟草表皮细胞中的亚细胞定位。(b)全长MdARF1转录活性的鉴定。（-T）代表一种缺乏Trp的选择性培养基，而（-T/-H/-A）则是一种缺乏Trp、His和Ade的选择性培养基。这些培养基配方使其能够区分酵母细胞中的转录活性。

4MdARF1过表达增强苹果对炭疽病的抗性

为了阐明MdARF1在赋予炭疽病抗性中的作用，研究者通过农杆菌介导的转化获得过表达MdARF1的转基因株系（MdARF1-OE7）。MdARF1在MdARF1-OE1和MdARF1-OE1和MdARF1-OE1和MdARF1-OE3的表达水平升高。随后，研究者将两个Mdm-miR7125过表达的转基因株系用炭疽病感染。结果显示，过表达Mdm-miR7125导致植物对病菌易感（图6b，c）。然后，研究者通过瞬时转化将Mdm-miR7125瞬时转化到“HF”苹果叶和果实中，将炭疽病孢子悬浮液置于注射部位；以水和空载体作为对照条件，观察接种后的表型。结果显示，过表达Mdm-miR7125的苹果叶片的损伤面积明显大于对照组，表明过表达Mdm-miR7125降低了苹果对炭疽病的抗性（图6d，e）。在苹果果实上，过表达的第3天和第5天Mdm-miR7125的损伤面积均明显大于对照组，并随着时间的推移逐渐增加（图6f，g）。这些结果表明，Mdm-miR7125的过表达导致了对炭疽病的易感性。

图5.MdARF1基因上游miRNA的鉴定。(a)基因构建物的示意图。(b)MdARF1是miR156的靶点。(c)qRT-PCR分析过表达Mdm-miR7125的苹果愈伤组织中MdARF1的表达水平。误差线表示三个生物重复的标准偏差（SD）。星号表示差异显著（**P＜0.01，基于t检验）。(d)LUC分析确定了miR7125和miR390对MdARF1和MdMYB46之间调控关系的影响。

图6.Mdm-miR7125过表达抵抗炭疽病分析。(a)qRT-PCR分析了Mdm-miR7125在感染炭疽病“Hanfu”植株中的相对表达量。(b)pRI101-AN（对照）、Mdm-miR7125-OE3感染炭疽病苹果愈伤组织的表型，比例尺1cm。(c)苹果愈伤组织生长的定量分析。(d)感染炭疽病的pRI101-Mdm-miR7125，空载体(pRI101)分离叶片的表型；比例尺1cm。(e)空载体(pRI101)、H2O和pRI101-Mdm-miR7125离体叶片中Mdm-miR7125相对表达量的qRT-PCR分析。误差线表示三个生物重复的标准偏差（SD）。星号表示差异显著（*P＜0.05，**P＜0.01，基于t检验）。(f)感染炭疽病瞬时表达pRI101-Mdm-miR7125、pRI101-AN（对照）的苹果果实的表型，比例尺1cm。(g)苹果果实病变的直径分析。误差线表示三个生物重复的标准偏差（SD）。星号表示差异显著（*P＜0.05，基于t检验）。

6miR7125-MdARF1模块响应SA信号提高抗病能力

SA是一种重要的植物防御激素。研究者分析了miR7125的启动子，发现了响应SA的作用元件。为了确定miR7125-MdARF1-MdMYB46模块是否在对炭疽病的响应中发挥作用，研究者测定了感染炭疽病的苹果叶片中内源性SA的水平（图7a）。结果表明，SA信号在炭疽病的抗性中起着关键作用。值得注意的是，SA含量正向调节胁迫响应，在24h时达到峰值。为了进一步研究外源性SA的应用是否会改变叶片中内源性SA含量和miR7125、MdARF1和MdMYB46的表达水平，研究者用1月龄的“Hanfu”苹果植株进行了实验。研究者应用0.1mmol/L的SA，并在0、12、24、36和48h对植株进行取样，以评估内源性SA含量和miR7125、MdARF1和MdMYB46表达谱的变化。结果显示，内源性SA水平增强，miR7125表达下调，MdARF1和MdMYB46表达明显上调（图7b-e）。

图7.miR7125-MdARF1模块中SA信号的qRT-PCR分析。(a)感染炭疽病的“Hanfu”苹果植株内源SA含量。（b-e）施用SA的1月龄“Hanfu”苹果中内源性SA含量和miR7125、MdARF1、MdMYB46表达水平。误差线表示三个生物重复的标准偏差（SD）。星号表示差异显著（*P＜0.05，**P＜0.01，基于t检验）。

讨论

1SA信号通路增强了苹果对炭疽病的抗性

SA在植物的免疫应答中起着重要的作用。在被病原体感染后，植物的SA合成急剧增加，SA合成是增强植物对病原体抗性的关键信号分子。拟南芥感染白粉菌后，内源性SA含量增加到正常水平的5倍。SA分解代谢基因nahG在烟草和拟南芥中的过表达导致了植物中SA含量的降低，从而显著影响了植物对病原体侵染的响应。内源SA积累的减少导致植物与病原体相互作用初期的超敏反应（HR）被抑制，最终降低了植物对病原体的抗性。因此，植物的防御反应的后续阶段，包括SAR，会受到SA消耗的不利影响，这可能会损害植物对病原体的抗性。外源施用SA也能提高植物的抗病能力。SA的应用有效提高了玉米锈病的抗病能力。施用SA可减少杏果实黑斑病。此外，SA的应用也增强了苹果对炭疽病的抗性。本研究观察到接种炭疽病后苹果植株内源SA水平的增加（图7a）。此外，外源SA的应用诱导了植物内源SA水平的显著增加（图7b）。内源和外源SA均有助于增加苹果对炭疽病的抗性。

2miR7125-MdARF1模块促进木质素的合成，以响应SA信号传导

SA和木质素在植物抗病过程中都起着重要的作用。SA可以提高植物中木质素相关酶的活性。这种酶活性的增加对植物的各种生理过程至关重要，包括细胞壁的强化和抵御病原体的防御机制。水稻施用SA后，与木质素合成相关的POD（过氧化物酶）活性的快速增加，这导致了木质素合成的快速增加，并最终增强了对稻瘟病菌的抗性。SA处理已被证明可以通过诱导拟南芥叶片内PAL和POD活性的增加和促进木质素的积累来降低灰霉病的发生率。SA还能诱导木质素合成相关基因的上调。这种上调导致了木质素产量的增加，这是植物抗病性的关键。之前研究表明，SA可以上调茶叶中CsCAD1和CsCAD2的表达，而CsCAD1在木质素的生物合成中起着关键作用。SA诱导了DkWRKY8和DkWRKY10的表达。这些基因在柿子中过表达增强了对炭疽菌的抗性。SA可以促进木质素的合成，但其分子机制尚不清楚。本研究发现了一个将SA信号通路与苹果中的木质素生物合成联系起来的途径。miR7125-MdARF1模块增强了木质素的生物合成，以响应SA信号传导，从而提高了苹果对炭疽病的抗病能力。当炭疽病感染苹果时，苹果中SA含量增加（图7a），而miR7125的表达量下降（图7c）。miR7125表达的减少增强了其靶基因MdARF1的表达（图5）。MdARF1与MdMYB46启动子内的GACA位点结合（图2），并正向促进MdMYB46的转录（图2e）。MdMYB46可以激活MdCAD、MdCOMT、MdCCR等生物合成基因，促进木质素的合成，最终提高苹果的抗病能力。

综上所述，本研究结果显示，miR7125-MdARF1模块在诱导苹果对炭疽病抗性的分子机制中起着关键作用，该模块促进木质素的合成以响应SA信号，从而赋予了对炭疽病胁迫的抗性。本研究结果还为培育抗炭疽病苹果品种的分子育种策略提供了思路。