细小病毒是猫病毒群的常见病毒，通常会导致猫的胃肠炎和白细胞减少症。在本研究中，我们从中国家猫中鉴定了一种新的原细小病毒，它在遗传上与犬细小病毒相似(98.0%-99.8%)，但在病毒结构蛋白2(VP2)中与众所周知的犬细小病毒2型和猫泛白细胞减少症病毒具有低氨基酸同源性(36.1%-37.2%)。这种病毒暂时命名为猫bufavirus(FBuV)。粪便样本筛查显示家猫的患病率为7.4%(19/257)。FBuV阳性的猫中有52.6%(10/19)出现腹泻。然而，统计分析显示FBuV和临床症状之间没有联系。对19株FBuV的VP2基因进行了测序，系统发育分析表明，来自中国的FBuV具有遗传多样性。本研究将加深对布氏病毒流行病学和遗传多样性的认识，为进一步研究提供基础。

细小病毒是一种小型、无包膜的单链DNA病毒。DNA基因组长度约为4.5–5.5kb，在5′和3′端具有复杂的发夹结构，编码3或4种蛋白质：非结构蛋白1（NS1）、核蛋白1（NP1）、病毒结构蛋白1和2（VP1和VP2）（Cotmoreetal.,2014）。细小病毒属于细小病毒科。该家族中的病毒主要分为三个亚家族：细小病毒亚科，其中包含感染脊椎动物宿主的病毒；浓核病毒亚科，包括感染节肢动物宿主的病毒；以及包括无脊椎动物和脊椎动物病毒的Hamaparvovirinae（Ṕenzesetal.,2019;Souzaetal.,2017）。细小病毒亚科包括博卡病毒属和原细小病毒属（Martinoetal.，2019；Mirandaetal.，2017），其成员已在包括家养食肉动物在内的多种哺乳动物物种中鉴定。

猫细小病毒(原细小病毒属)广泛存在于猫中，通常引起猫胃肠炎和白细胞减少，具有高死亡率和发病率(Liuetal.,2020)。最近，在猫中发现了几种新的细小病毒(表1)。2012年，香港报告了细小病毒亚科博卡病毒属的一种新病毒，即猫博卡病毒(FBoV)(Lauetal.,2012)。目前，该病毒已被分为三种基因型，并在中国、美国、日本、葡萄牙和泰国有报道(Lauetal.,2012;Ngetal.,2014;Zhangetal.,2014)。2019年，在加拿大的一个多设施猫科动物收容所中描述了猫cha-phamaparvirus(FECHPV)，属于一个名为Hamaparvovirinae的新亚科(Lietal.,2020)。目前，FeChPV已被鉴定为猫病毒组的共同成分。流行病学研究表明，FeChPV感染在患有急性肠胃炎的猫中很常见(DiProfioetal.,2021)。

2019年，在意大利从患有呼吸道症状和腹泻的猫身上鉴定出了另一种新的细小病毒（Diakoudietal.,2019），该病毒与犬bufavirus（CBuV）基因相关。CBuV于2018年在意大利被发现（Sunetal.,2019a），但目前是一种未分类的原细小病毒，符合国际病毒分类委员会（ICTV）划分细小病毒科的分类标准().在之前的研究中，FBuV在猫中的流行率为9.2%，这表明FBuV似乎已成为猫病毒群中的一种常见元素。然而，FBuV自首次发现以来，仅在意大利有报道。在这项研究中，首次从中国家猫的粪便样本中鉴定出FBuV，这为进一步了解BuV的分子特征和流行病学提供了更多信息。

2020年，共从中国广东省健康或腹泻的家猫身上采集了257份粪便样本。这些动物包括221只健康猫和36只腹泻猫（表2）。粪便样品在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中以1%的比例匀浆，然后在4◦C培养20分钟以收集上清液。根据制造商的说明，使用MiniBEST病毒RNA/DNA提取试剂盒（日本Takara）从200μl上清液中提取每个样本的基因组DNA，然后储存在-80◦C，直到进一步使用。

为了检测BuV的存在，使用如前所述的特异性引物(CPPV-165f5′-ctggtttaatccagact-3′和CPPV-371r5′-TGAAGACCAAGGTAGTAGGT-3￡)通过聚合酶链反应对所有样品进行了检测(Diakoudietal.,2019)。电泳显示PCR产物为预期的202bp大小，表明为BuVDNA阳性。然后使用FastPure凝胶DNAExtractionMiniKit(Vazyme，Nanjing，China)纯化扩增的DNA片段，并克隆到pCloneEZ-TA载体(CloneSmar-ter，USA)中，通过转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞(狄威，China)中并测序。培养12小时后，挑取细菌克隆并通过PCR鉴定，阳性大肠杆菌克隆被鉴定并送去测序(中国武汉天一)。对，与以前报道的BuV毒株相比，BuV的核苷酸相似性为99.32%-100.00%。

基于可获得的CBuV基因组序列，使用两个不同的引物对扩增VP2编码区的部分基因组，正向引物FBuV-2686f(5￣cgcaaagacaggtccatctt-3￣和反向引物FBuV-2905r(5￣tatttcaaagttcattgca-GATTGCT-3￣2);正向引物FBuV-2800f(5-CACTA-TAAATGACTCTTACCATGCA-3)和反向引物FBuV-3256r(5-AGTTCGATTGGTACACAGTTTTC-3)。使用PhantaMax超保真DNA聚合酶(Vazyme,China)扩增目标片段(244bp和480bp),然后纯化并连接到pCloneEZ载体(CloneSmarter,UnitedStates)中。通过转化将质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(Weidi,China)中并测序。用组装阳性样品的核苷酸序列。

PCR检测显示，257份粪便样本中有19份FBuV阳性，总阳性率为7.4%(19/257)。腹泻症状组FBuV阳性率为27.8%(10/36)，无任何临床症状组为4.1%(9/221)(表2)。然而，统计分析显示FBuV的存在与临床症状之间没有关联()。所有19个毒株中FBuV的部分VP2编码区为594BP(GenBank登录号:MW970061-MW970076和MW6889)这些毒株与意大利报道的FBuV毒株的遗传相似性为99.2%-99.8%，与犬BuV的遗传相似性为99.2%-100.0%。

为了了解本研究中鉴定的FBuV株与其他bufavvirus株之间的进化关系，从GenBank数据库中获得了其他bufavvirus株的vp2编码序列。在使用“寻找最佳DNA/蛋白质模型”程序进行估计后，使用Tamura-Nei模型构建了具有gamma分布和不变位点(G+I)替换的最大似然(ML)系统发育树，使用进行1000次引导重复。与其他bufavvirus株相比，FBuV毒株和CBuV毒株紧密聚集，远离其他毒株（图1A）。基于食肉动物原细小病毒的分支表明，从中国鉴定出的肉食性bufavvirus毒株与从其他地区分离出的犬和猫bufavvirus株相对遥远(图1B)。值得注意的是，菌株GD64在进化树中形成了单独的分支，使得中国FBuV变异更加多样化。

图1.利用进行最大似然法和1000次引导复制的启发式搜索。基于VP2部分基因组（594bp）的buv系统发育树。B系统发育树中食肉动物分支的放大视图。经国际国家病毒分类委员会正式承认的原细小病毒与非分类（NC）原细小病毒一起包括在内。提供了参考菌株的GenBank登录号。本研究中的菌株用黑色圆圈

近年来，由于第二代测序（NGS）和元基因组学的发展，已经发现了几种新型细小病毒。bufavvirus于2012年在布基纳法索首次在急性腹泻患者的粪便中检测到（Phanetal.,2012）。从那时起，在全世界所有年龄段的患者的腹泻粪便中都发现了人类BuV（Altayetal.,2015;Dalenoetal.,2012;Huangetal.,2015;Yahiroetal.,2014）。随后，发现了几种新物种感染了BuV，如蝙蝠（Kemenesietal.,2015）、鼩和非人灵长类动物（Sasakietal.,2015）、猪（Hargitaietal.,2016a）、大鼠（Yangetal.,2016）、犬（Sunetal.,2019a）和猫（Diakoudietal.,2019）。在中国，BuV于2015年首次从急性腹泻患者中检测到（Huangetal.,2015）。五年内，在大鼠（Sunetal.，2020；Yangetal.，2016）、猪（Sunetal，2020）和犬（Sunetal.,2019a）中发现了BuV感染的进一步证据。在这项研究中，我们发现家猫体内存在BuV感染，这表明BuV在中国的宿主范围正在扩大。

作为一种DNA病毒，细小病毒的突变率低，VP2基因具有高度的遗传和抗原多样性（Doanetal.,2021）。与已知的犬细小病毒2型和猫泛白细胞减少症病毒相比，新型猫原细小病毒VP2基因的nt（54.8-55.3%）和aa（36.1-37.2%）同源性较低，与犬bufavvirus的相似性最高（98.0%-99.8%）。此外，本研究中分离到的一些猫bufavvirus毒株VP2基因突变率很高，其中GD64与其他毒株相差甚远，并在系统发育树中形成了一个单独的分支，这表明在中国流行的bufavvirus具有遗传多样性。

中国有大量的宠物，广东省的宠物数量最多，约占全国宠物总数的11%(，它们有着密切的亲缘关系，经常共享相似的栖息地，这为病毒在它们之间的物种间传播提供了优势。已经证实，冠状病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒和细小病毒可以在这两个物种之间传播（Shackeltonetal.,2005;Lauetal.,2012;Herreweghetal.,1998;Truyen,2006）。在本研究中，系统发育分析表明，中国猫BuV毒株与从中国分离的CBuV毒株更为密切，并聚集在意大利猫bufavirus毒株的不同分支中，这表明在中国传播的bufavirus可能是猫和犬之间的共同进化，并对家养宠物构成威胁。

Bufavirus可感染所有年龄的人和动物，受感染的动物可能会出现呼吸道和/或腹泻症状（Ayounietal.,2016;Lietal.,2019;Liuetal.,2016;Yahiroetal.,2014）。有人提出，BuV可能与猪的后部麻痹有关（Ayounietal.,2016;Lietal.,2019;Liuetal.,2016;Yahiroetal.,2014）。BuV在人、猪和犬中的患病率分别为0.27%-1.1%、0.86%-23%和1.85%-31%（Sunetal.,2019b;Wangetal.,2020;Yahiroetal.,2014）。FBuV于2017年在意大利首次被识别。在这项研究中，家猫（9.2%）的FBuV被测定，尤其是幼猫。该病毒在鼻和口咽标本中的患病率（10.2%）高于肠道标本（2.2%）。此外，有呼吸道症状的猫的阳性率（16.4%）高于无症状动物（8.7%）。在本研究中，257个样本中有19个样本FBuV阳性（7.3%），FBuV呈阳性病例中也发现了腹泻症状（10/19）。然而，需要进一步尝试分离FBuV并在猫身上进行chal-lenge实验，以研究猫bufavirus的致病性。

总之，我们在中国发现了一种新的猫细小病毒，它在遗传上与犬科bufavvirus相关。介绍了FBuV的流行、基因组特征和遗传多样性。此外，猫科和犬科bufavvirus之间的高度相似性表明，这两种食肉动物物种之间可能存在种间传播。这些结果丰富了对中国BuV流行病学和遗传多样性的认识。

RanShao:Conceptualization,Investigation,Writing–originaldraft.

CundongYe:Software,Validation,Writing–:::::::::::Supervi-sion,:Supervision,Projectadministration.

作者声明他们没有利益冲突。

这项工作得到了国家自然科学基金（31702271）和广东省自然科学基金资助（2017A030310367）。

这项研究没有涉及任何人类参与者或活体动物实验。

Altay,A.,Yahiro,T.,Bozdayi,G.,Matsumoto,T.,Sahin,F.,Ozkan,S.,Nishizono,A.,Söderlund-Venermo,M.,Ahmed,K,2015.(10),965.

Ayouni,S.,Estienney,M.,Hammami,S.,NejiGuediche,M.,Pothier,P.,Aouni,M.,Belliot,G.,deRougemont,A.,2016.Cosavirus,(9),e0162255.

Cotmore,,Agbandje-McKenna,M.,Chiorini,,Mukha,,Pintel,,Qiu,J.,Soderlund-Venermo,M.,Tattersall,P.,Tijssen,P.,Gatherer,D.,Davison,,2014.(5),1239–1247.

Daleno,C.,Piralla,A.,Scala,A.,Baldanti,F.,Usonis,V.,Principi,N.,Esposito,S.,2012.CompleteGenomeSequenceofaNovelHumanEnterovirusC(HEV-C117)(19),10888–10889.

DiProfio,F.,Sarchese,V.,Palombieri,A.,Fruci,P.,Massirio,I.,Martella,V.,Fulvio,M.,DiMartino,B.,2021.Felinechaph

Diakoudi,G.,Lanave,G.,Capozza,P.,DiProfio,F.,Melegari,I.,DiMartino,B.,Pennisi,,Elia,G.,Cavalli,A.,Tempesta,M.,Camero,M.,Buonavoglia,C.,Bányai,K.,Martella,V.,2019.,246–251.

Doan,,Le,,Do,,Nguyen,,Le,,2021.Canineparvovirustype2cinVietnamcontinuestoproducedi

Hargitai,R.,Pankovics,P.,Kert́esz,,Bíró,H.,Boros,Á.,Phan,,Delwart,E.,Reuter,G.,2016(4),1033–1037.

Herrewegh,,Smeenk,I.,Horzinek,,Rottier,,deGroot,,1998.FelinecoronavirustypeIIstrains79-1683and79-1146originatefromadoubl(5),4508–4514.

Huang,D.,Wang,W.,Lu,Q.,Zhao,J.,Guo,C.,Wang,H.,Zhang,X.,Tong,Y.,Liu,W.,Cao,W.,2015.IdentificationofBufavirus-1andBufavirus-3inFecesofPatientswithAcuteDiarrhea,(1).

Kemenesi,G.,Dallos,B.,Görföl,T.,Estók,P.,Boldogh,S.,Kurucz,K.,Oldal,M.,Marton,S.,B́anyai,K.,Jakab,F.,2015.Geneticdiversityandrecombinationwithinbufaviruses:,288–292.

Lau,,Woo,,Yeung,,Teng,,Wu,Y.,Bai,R.,Fan,,Chan,K.,Yuen,K.,2012alsanovelfelinebocavirusandanovelgeneticgroupofcaninebocavirus.

(7),1573–1582.

Li,J.,Cui,L.,Deng,X.,Yu,X.,Zhang,Z.,Yang,Z.,Delwart,E.,Zhang,W.,Hua,X.,2019.Caninebufavirusinfaecesandplasmaofdogswithdiarrhoea,(1),245–247.

Li,Y.,Gordon,E.,Idle,A.,Altan,E.,Seguin,,Estrada,M.,Deng,X.,Delwart,E.,2020.ViromeofaFelineOutbreak(5),506.

Liu,L.,Schwarz,L.,Ullman,K.,Ahola,H.,Qiu,Y.,Ma,Z.,Hennig-Pauka,I.,2016.Identific(7),1592–1596.

Liu,M.,Li,M.,Ma,C.,Shi,C.,2020.Detectionofcanineparvovirusandfeli(6),880–886.

Martino,D.,Profio,D.,Melegari,Marsilio,2019.FelineVirome—(10),908.

Miranda,C.,Vieira,,Silva,E.,Carvalheira,J.,Parrish,,Thompson,G.,2017.GeneticAnalysisofFelinePanleukopeniaVirusFull-lengthVP2GeneinDomesticCatsBetween2006-2008and2012-2014,(4),1178–1183.

Ng,,Mesquita,,Nascimento,,Kondov,,Wong,W.,Reuter,G.,Knowles,,Vega,E.,Esona,,Deng,X.,Vinj́e,J.,Delwart,E.,2014.(1-2),102–111.

Ṕenzes,,deSouza,,Agbandje-McKenna,M.,Gifford,,2019.AnAncientLineageofHighl(6),525.

Phan,,Vo,,Bonkoungou,,Kapoor,A.,Barro,N.,O’Ryan,M.,Kapusinszky,B.,Wang,C.,Delwart,E.,2012.AcutediarrheainWestAfricanchildren:(20),11024–11030.

Sasaki,M.,Orba,Y.,Anindita,,Ishii,A.,Ueno,K.,HangOmbe,,Mweene,,Ito,K.,Sawa,H.,2015.(7),1230–1233.

Shackelton,,Parrish,,Truyen,U.,Holmes,,2005.Highrate(2),379–384.

Souza,,Romeiro,,Fumagalli,,Modha,S.,deAraujo,J.,Queiroz,,Durigon,,Figueiredo,,Murcia,,Gifford,,2017.Chapparvovirusesoccurinatle(2),225–229.

Sun,W.,Zhang,S.,Huang,H.,Wang,W.,Cao,L.,Zheng,M.,Yin,Y.,Zhang,H.,Lu,H.,Jin,N,2019,127–131.

Sun,W.,Zhang,S.,Huang,H.,Wang,W.,Cao,L.,Zheng,M.,Yin,Y.,Zhang,H.,Lu,H.,Jin,N,2019,127–131.

Sun,Y.,Chen,Y.,Cai,Y.,Zhu,D.,Pan,H.,Wei,Y.,Han,X.,Ji,C.,Lu,G.,Wang,H.,Ma,C.,Zhang,G.,2020.(1).

Truyen,U.,2006.Evolutionofcanineparvovirus–aneedfornewvaccines?(1),9–13.

Wang,Y.,Guo,X.,Zhang,D.,Sun,J.,Li,W.,Fu,Z.,Liu,G.,Li,Y.,Jiang,S.,2020.GeneticandphylogeneticanalysisofcaninebufavirusfromAnhuiProvince,,104600.

Yahiro,T.,Wangchuk,S.,Tshering,K.,Bandhari,P.,Zangmo,S.,Dorji,T.,Tshering,K.,Matsumoto,T.,Nishizono,A.,Söderlund-Venermo,M.,Ahmed,K,2014.NovelHumanBufavirusGenotype3inChildrenwithSevereDiarrhea,(6),1037–1039.

Yang,S.,Liu,D.,Wang,Y.,Qu,F.,He,Y.,Sun,Z.,Shen,Q.,Li,W.,Fu,X.,Deng,X.,Zhang,W.,Delwart,E.,2016.(1),130–133.

Zhang,W.,Li,L.,Deng,X.,Kapusinszky,B.,Pesavento,,Delwart,E.,2014.(Pt11),2553–2564.